文献解读|Cell Metab（30.8）：大规模宏蛋白质组学研究揭示了人类肠道菌群在代谢性疾病和衰老过程中的功能

人类肠道微生物群对宿主的生理、代谢和免疫功能有着深远的影响。肠道微生物组成和功能的改变与多种疾病相关，包括癌症、2型糖尿病（T2D）、肥胖和心血管疾病。虽然新一代测序技术的进步彻底改变了大众对肠道微生物与宿主因素（如年龄、性别、饮食和健康状况）之间关系的理解，但大多数研究依赖于基因测序或转录组测序，而这些测序揭示的是遗传潜能而非功能活性。现有的宏基因组学研究主要关注分类学变化和功能潜力，而对导致疾病的微生物功能尚不明确。此外，尽管治疗代谢性疾病的药物会显著改变微生物组成，但这些改变在蛋白质水平上的功能后果仍未得到充分阐明，因此药物疗效是否部分源于微生物组的调节尚不清楚。人类肠道菌群在大样本人群中的蛋白质水平功能及其与宿主因素的关联仍未得到充分研究。

本研究纳入了来自广州营养与健康研究（GNHS）队列的1399名中老年参与者。研究团队收集了1399名参与者的1967份粪便样本，其中包括568名个体的纵向样本（中位间隔3.2年）（图1A）。这些数据包含50种与生活方式、人口统计学特征、饮食、生物医学指标、人体测量学、代谢紊乱、自述疾病、药物使用和抗生素使用相关的临床和问卷调查表型。

他们采用基于diaPASEF的宏蛋白质组学分析方法研究了肠道菌群的功能谱（图1B）。共采集了2512个DIA-MS谱图，包括1967个粪便样本和545个质控样本。在所有粪便样本中，检测到452619个肽前体、8042个属于1456个人类蛋白质的人类特异性肽，以及357524个属于92082个微生物蛋白质组的微生物特异性肽（图1C）。分类学分析涵盖46个门、325个属和456个种，功能注释结果包括2753个直系同源基因聚类（COG）和2973个KEGG直系同源基因聚类（KO）（图1C）。为了评估长时间采集的数据质量，他们在每个批次内和批次间均采集了多对技术重复和生物学重复样本。他们从多个层面评估了微生物的分类和功能多样性，包括人类蛋白质、微生物蛋白质、COG、KO和分类学。545个质控重复样本在各个层面均表现出高度相关性，且Bray-Curtis (BC) 距离紧密聚集（图1D，图S1A）。重复样本间的BC距离无显著批次间差异（图S1B）。相比之下，随机匹配样本的相关性显著低于质控重复样本，且BC距离显著高于质控重复样本（图S1A-B）。主坐标分析（PCoA）进一步验证了这些结果，表明样本分布一致，批次效应极小，并证实了数据的完整性和可靠性（图S1C）。

在每个样本中，平均鉴定出 56009 ± 20771个肽前体、561 ± 127 个人类蛋白质、16731 ± 5769 个微生物蛋白质、182 ± 45个属、242 ± 61个种、1508 ± 278 个微生物 KO和 1539 ± 243 个微生物 COG （图 1E）。微生物分类注释率的中位数为 90.3%，而微生物功能注释率的中位数分别为 KO 76.1% 和 COG  95.0%（图 S1-E）。在微生物功能和分类水平上观察到宏蛋白质组丰富度的显著差异（图 S1F），这与之前的群体规模宏基因组学研究结果一致。微生物蛋白的数量约为人类蛋白的30倍，总丰度高出5.8倍（图S1G）。宏蛋白质组学数据揭示了GNHS人群肠道微生物组的分类和功能图谱。

与PERMANOVA分析结果一致，对于每个因素，2型糖尿病药物、布里斯托尔便秘量表、甘油三酯、2型糖尿病、饮茶和年龄是最具影响力的表型（图2A）。分类单元水平的关联性证实了之前的报道。例如，Anaerotruncus与便秘呈正相关，而Romboustsia与2型糖尿病呈负相关。饮茶者表现出格Gemmiger水平升高和Tyzzerella水平降低（图2B）。在功能水平上，鉴定了与这些表型显著相关的微生物和宿主蛋白功能。在微生物KO水平上，核糖体蛋白L29和S20与腹泻呈正相关，与便秘呈负相关。半乳糖激酶、GTP酶和鸟苷二磷酸（GDP）甘露糖4,6-脱水酶与便秘呈正相关。在糖尿病患者中，与半乳糖代谢、氨基酸代谢、糖酵解和H/Na离子转运相关的KO呈负相关，而参与淀粉和糖原代谢、蛋白质和肽代谢以及柠檬酸循环的KO则呈正相关（图2C）。在人体蛋白质水平上，黏蛋白和蛋白酶体亚基与腹泻呈正相关。在便秘患者中，黏蛋白、胰腺分泌颗粒膜主要糖蛋白GP2和α-淀粉酶相关蛋白SLC3呈负相关，而小整合膜蛋白SIM22、抗原CD9和硫酸盐转运蛋白S26A2则呈正相关（图2D）。

衰老是多种慢性疾病和功能障碍的主要风险因素，越来越多的证据表明衰老与肠道微生物群之间存在双向关系。宏蛋白质组学分析揭示了773个与年龄显著相关的特征，包括17个人类蛋白质、573个微生物蛋白质、2个属、1个种、115个功能性KO和65个COG。通过纵向（受试者内）分析进一步验证了这些横断面（受试者间）关联。该方法鉴定出161个与衰老相关的核心特征，包括10个人类蛋白质、1个属、36个KO、21个COG和93个微生物蛋白质组（图3A）。在分类学层面，横断面和纵向分析均表明，Bacillota的Phascolarctobacterium数量随年龄增长而减少（图3B）。这些发现与之前的报道一致，即产生丙酸的共生菌Phascolarctobacterium数量随年龄增长而减少，并且与健康老龄化表型相关。

对微生物组的功能分析显示，微生物KO功能与维持生存所必需的保守代谢功能之间存在一致的负相关性（图4A）。这些代谢功能包括营养转运蛋白、糖酵解和发酵酶以及离子转运酶，它们支持碳代谢、短链脂肪酸（SCFA）合成和厌氧呼吸。通路富集分析表明，这些差异表达的微生物蛋白主要参与碳代谢、磷酸戊糖途径、氨基酸生物合成、生物素代谢、单环β-内酰胺类抗生素生物合成和脂肪酸生物合成（图4B）。

功能改变与分类学鉴定相结合的结果表明，源自Parabacteroides distasonis的周质pH依赖性丝氨酸内肽酶DegQ与代谢性疾病呈正相关。此外，来自Megasphaera elsdenii的通用应激蛋白UspA和外膜孔蛋白OmpC也与这些疾病呈正相关（图4C）。相反，Bacillota表达的蛋白质与代谢性疾病呈负相关（图4C）。F. prausnitzii在多个通路中均表现出蛋白质丰度降低，包括碳水化合物转运和代谢（mglA、PhnK和gnpA）、防御机制（RbbA）、核苷酸转运和代谢（MdlB和NupO）、能量产生和转化（WcaA和IlvD）、辅酶转运和代谢（coaBC）以及无机离子转运和代谢（cbiO）。同样，Roseburia intestinalis和Anaerostipes hadrus与脂质转运和代谢蛋白（hbd和bcd）呈负相关，而其他芽孢杆菌属，如Blautia、Gallintestinimicrobium、Flintibacter、Brotocaccenecus、Agathobacter和Lachnospira，则与氨基酸转运和代谢（ugpC-1、gdh和IscU）、翻译后修饰（gdh）、信号转导（hprK）和能量产生（pflB）相关的蛋白呈负相关。这些负相关还延伸至翻译和核糖体生物合成（rpIE、rpID 和 rnJ）、细胞周期调控（UPF0210）以及细胞壁/膜生物合成（WcaA），表明代谢性疾病状态下微生物代谢能力受损（图 4C）。总之，研究结果表明，保护性厚壁菌蛋白的减少与应激相关蛋白的增加同时发生。这种模式凸显了肠道菌群失调的一个关键方面，即有益细菌的减少可能导致代谢紊乱加剧，凸显了以微生物为靶点的干预措施在疾病管理中的潜力。

他们观察到代谢性疾病药物与宏蛋白质组学特征之间存在显著关联。虽然用药方案各异，但分析用药状态和未用药状态下不同的宏蛋白质组学模式，能够为疾病相关特征和与治疗状态相关的潜在生物标志物提供宝贵的见解。因此，他们将受试者分为非疾病组（ND）、未治疗疾病组（UD）和治疗疾病组（TD）。然后，分析了各组间每项特征的统计关联，比较了UD与ND以及TD与ND之间的差异。与UD显著相关但与TD无显著关联，或在两组间呈现不同模式的特征归类为“药物相关特征”，代表了因治疗状态而异的疾病相关模式。相反，与TD特异性相关（但与UD无显著相关）的特征归类为“药物特异性特征”。总共在糖尿病、高血压（HBP）和血脂异常(DLP)中鉴定出43034个药物相关特征（图5A）。这项分析将接受不同治疗方案的个体结合起来，为本研究提供了药物干预在宏观层面如何与功能转变相关的初步概述。

药物相关的微生物蛋白模式揭示了不同疾病中物种水平的显著差异。在2型糖尿病（T2D）中，包括厚壁菌门（F. prausnitzii和Roseburia faecis）、放线菌门（产气柯林斯菌）和拟杆菌门（Phocaeicola plebeius和Segatella copri）在内的关键有益菌种表达的蛋白，与UD显著相关，但在TD中这种相关性减弱或逆转（图5B）。在HBP患者样本（主要为F. prausnitzii、Hominimerdicola aceti、Agathobacter rectalis、P. plebeius和S. copri）和DLP患者样本（主要为F. prausnitzii、A. rectalis、Phocaeicola coprocola、Bifidobacterium pseudocatenulatum、和B. adolescentis）中也观察到了类似的模式（图5B）。值得注意的是，在所有三种疾病中，F. prausnitzii均表现出对药物有反应的关键菌种特性，并呈现出疾病特异性的方向性模式。在T2D中，F. prausnitzii蛋白表现出疾病阳性、治疗阴性/无效的关联（D [+] T [↓]）——与UD呈正相关，但在TD中这种关联减弱或逆转。相比之下，在HBP和DLP中，这些蛋白表现出疾病阴性、治疗阳性/无效的关联（D [−] T [↑]）——与UD呈负相关，但受治疗调节（图5B）。功能富集分析显示，在DLP中，普氏梭菌蛋白主要在半乳糖代谢和肽聚糖生物合成中呈负富集，而在RNA聚合酶中呈正富集。在HBP中，这些蛋白质与多种代谢途径（碳水化合物、核苷酸、氨基酸代谢和翻译）呈负相关，但与脂质代谢（包括脂肪酸生物合成）呈正相关。在T2D中，除了与碳水化合物、核苷酸和氨基酸代谢、聚糖生物合成和翻译广泛呈正相关外，F. prausnitzii蛋白质还与磷酸转移酶系统显著相关（图5C）。

人类蛋白质关联分析也揭示了不同的疾病特异性模式，特别是肌球蛋白、核糖体蛋白、细胞色素c亚基和免疫球蛋白。肌球蛋白在三种疾病中呈现出相反的关联方向。在DLP和T2D中，大多数肌球蛋白与UD组的疾病呈正相关，而治疗改变了这些关联。有趣的是，HBP呈现出相反的模式，因为大多数肌球蛋白与UD呈负相关（图5D）。这些对比鲜明的模式可能反映了血管平滑肌中不同的代偿机制：脂质沉积导致血管壁弹性增加，而慢性HBP则通过适应性降低血管阻力来缓解。对于核糖体蛋白，HBP与UD呈负相关，而T2D呈正相关，两者均受治疗调节（图5E）。细胞色素c亚基与未经治疗的T2D组呈正相关，并受治疗调节（图5F）。免疫球蛋白与未经治疗的T2D组呈负相关，并受治疗调节（图5G），这可能反映了与糖尿病相关的体液免疫和B细胞功能失调。总之，这些与药物相关的模式表明，目前的治疗方法可能部分通过纠正这些蛋白质水平异常而发挥疗效。

超过一半的物种特有微生物蛋白（683个中的470个）参与翻译、碳水化合物、氨基酸、脂质和核苷酸代谢以及能量产生。这凸显了这些功能在T2D中的关键调控作用。具体而言，27个物种根据其相互关系形成了3个不同的微生物群落聚类（图6A）。聚类1包含20个物种（主要来自Lachnospirales和Eubacteriales），这些物种表达的蛋白质参与翻译、核糖体生物合成以及碳水化合物和氨基酸代谢——这些功能主要与T2D呈负相关。聚类2包含4个双歧杆菌属物种，其蛋白质表达与T2D呈正相关，主要参与氨基酸转运和碳水化合物代谢。聚类3由2个巨球菌属物种组成，这些物种与T2D呈正相关，其蛋白质与能量产生和脂质代谢相关。

为了验证这些发现，他们从一个独立的FH队列中生成了宏蛋白质组学数据，该队列包含82名无T2D的个体和21名T2D患者。采用了两种互补的验证策略来确保研究结果的稳健性。首先，使用广义线性模型（GLM）证实了129个微生物蛋白组、1个人类蛋白、16个KO、10个COG、2个属和1个种与T2D的关联。经验证的特征主要属于聚类2和聚类3的物种。在聚类2中，他们验证了来自B. adolescentis（15个蛋白）和B. longum（9个蛋白）的与碳水化合物代谢和核苷酸转运相关的蛋白。在聚类3中，他们验证了来自M. elsdenii（36个蛋白）和M. hexanoica（6个蛋白）的与能量产生、脂质转运以及细胞壁/膜/包膜生物合成相关的蛋白。这些结果证明了聚类2和3在不同队列中的稳健性及其在糖尿病中的功能作用。其次，采用基于机器学习的5倍交叉验证方法进行验证。每个数据层级平均独立选择16个特征，其中40个微生物蛋白、31个人类蛋白、84个KO、90个COG、55个物种和41个属均对模型性能有持续贡献。将这些特征与七个传统的T2D风险因素（年龄、性别、BMI、腰围、甘油三酯、高血压和高密度脂蛋白[HDL]胆固醇）相结合的模型，在使用基于KO的特征时达到了最佳性能（图6B）。

为了研究T2D相关特征之间的功能相互作用，他们构建了一个共现网络，该网络整合了经跨队列聚类分析和机器学习验证的特征。结果显示，M. elsdenii是连接度最高的枢纽微生物（图6C）。该网络特别突出了T2D中M. elsdenii的上调蛋白，这些蛋白系统地组织成相互关联的功能模块。乳酸利用模块（LutB、LutC和GlcD）将积累的乳酸氧化为丙酮酸，从而产生还原当量。丁酸生成模块包含丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶 (nifJ)，该酶将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，并同时生成还原型铁氧还蛋白；乙酰辅酶A乙酰转移酶 (atoB)，用于乙酰乙酰辅酶A的缩合；以及3-羟酰辅酶A脱氢酶 (fadB) 和丁酰辅酶A脱氢酶 (bcd)，它们催化NADH依赖的还原步骤。至关重要的是，厌氧能量耦合模块包含RNF复合物（rnfC、rnfD和rnfG），该复合物通过重新氧化还原型铁氧还蛋白来维持氧化还原平衡，同时建立Na+梯度以驱动FoF1型ATP合酶 (atpD) 进行能量生成。辅助组分包括用于传递还原当量电子传递的电子传递蛋白（etfA和fixC）、用于确保 FAD/FMN 辅因子供应的核黄素合成酶（ribH）、用于维持铁硫簇蛋白（包括铁氧还蛋白、RNF 复合物和 LutB）铁稳态的铁蛋白（ftnA），以及用于保护氧敏感的铁氧还蛋白依赖性系统的抗氧化防御机制（dfx 和 rubR）。此外，多种外膜孔蛋白（OmpC）及其分子伴侣（OmpH）形成小分子被动扩散通道，促进乳酸内流和丁酸外流，从而支持M. elsdenii的高代谢通量（图6C）。这些发现强调了M. elsdenii及其代谢功能在T2D发展中的关键作用。

为了探究其在T2D病理生理学中的潜在作用，他们对M. elsdenii进行了详细研究。与非T2D对照组相比，T2D患者中M. elsdenii的检出率更高（60% vs. 49.6%），且丰度显著升高（图7A）。虽然既往研究报道M. elsdenii可将乳酸转化为丁酸，而丁酸通常与有益的代谢作用相关，但宏蛋白质组学分析揭示了功能上的差异：T2D患者中乳酸转化为丁酸途径的关键酶表达上调。重要的是，进一步研究发现，在所有检测到的微生物中，M. elsdenii对药物的反应最为敏感。与其他所有药物诱导的微生物蛋白相比，M. elsdenii蛋白与药物治疗的相关性最为显著，鉴于队列中 56.5% 的 T2D患者接受了药物治疗，这一发现尤为重要。对三个组——非糖尿病组（non-T2D）、未接受药物治疗的糖尿病组（NMDG）和接受药物治疗的糖尿病组（MDG）——进行逐步分析，结果显示M. elsdenii的丰度呈阶梯式增加（图 7 A），直接表明抗糖尿病药物促进了其富集。这一假设与先前报道服用二甲双胍的患者体内巨球菌水平升高的研究结果一致。为了验证抗糖尿病药物对M. elsdenii生长的直接影响，他们进行了体外生长实验，将M. elsdenii培养物暴露于二甲双胍、阿卡波糖和格列美脲中。细菌细胞计数和OD 600测量均证实，二甲双胍和阿卡波糖促进了M. elsdenii的生长，而格列美脲没有影响（图 7 B），这表明药物与微生物之间存在直接相互作用。

药物诱导的M. elsdenii富集促使他们研究其在葡萄糖调节中的潜在作用。他们给喂食高脂饮食（HFD）的无菌小鼠分别接种M. elsdenii或阳性对照菌株罗伊氏乳杆菌（已知具有降血糖作用）。在最初的14天内进行细菌定植，随后继续喂食HFD共42天，并全程监测空腹血糖（FBG）（图7C）。与普通饲料对照组（CD）相比，HFD显著升高了FBG，而罗伊氏乳杆菌（从第26天开始）和M. elsdenii（从第16天开始）治疗均显著降低了FBG水平（图7D）。与在宏蛋白质组学数据中观察到的丁酸生成途径上调一致，M. elsdenii处理的小鼠在 42 天后表现出比其他所有组都显著更高的肠道丁酸水平（图 7 E），这表明丁酸的产生可能介导了降低血糖的作用。

综合宏蛋白质组学、体外培养和鼠类实验的研究结果，揭示了一条潜在的机制通路：抗糖尿病药物（二甲双胍和阿卡波糖）促进M. elsdenii的生长，从而增强肠道丁酸的产生，并有助于维持葡萄糖稳态（图7F）。然而，仍需开展进一步研究来阐明完整的机制通路，建立因果关系，并确定其临床意义。

本研究对来自1399名中国中老年人的粪便样本进行了宏蛋白质组学分析，鉴定出与44种表型相关的微生物功能。由多种细菌驱动的碳代谢和能量产生功能随年龄增长而发生改变。在代谢性疾病中，观察到厚壁菌门菌种及其参与碳水化合物、能量、氨基酸代谢和短链脂肪酸产生的蛋白质持续减少。本研究还鉴定出与糖尿病、高血压和血脂异常相关的药物特征。在独立队列中验证后，M. elsdenii是2型糖尿病的关键菌种。实验验证表明，抗糖尿病药物能够促进M. elsdenii的生长，并且该菌可能通过产生丁酸来调节葡萄糖稳态。本研究从蛋白质水平上证实了微生物在健康和疾病中的功能，并揭示了潜在的治疗靶点。