文献解读|Nat Med（52.5）：通过血浆分析确定癌症免疫疗法疗效的代谢决定因素

代谢检查点是指一系列代谢开关，它们确保不同代谢途径的精确和动态转换，这对于从耐受性到免疫原性的转变至关重要，并可能与免疫抵抗机制相关。它们在肿瘤微环境（TME）中与成纤维细胞、髓系抑制细胞和肿瘤细胞竞争营养物质，从而调控树突状细胞（DC）和T细胞的发育、分化和功能。免疫检查点抑制剂（ICI）可使部分晚期癌症患者获益，但其疗效的代谢决定因素尚不明确。

研究团队对来自16个独立队列、8个不同地理位置、5种不同肿瘤类型的1714例患者的4336份早期治疗血浆样本进行了无偏倚的基于机器学习（MB）的分析，这些患者均接受了纵向随访。该研究涵盖了5种不同的基于ICI的治疗模式，包括粪便微生物移植（FMT）。采用最先进的机器学习（ML）方法，旨在实现两个目标：（1）发现与治疗反应密切相关的低维、不相关的临床-代谢血液特征；（2）验证其稳健性和在临床结局中的相关性。这些分析使用了训练队列和验证队列（图1），并采用DynForest （一种基于随机森林的联合纵向生存模型）以及严格的统计消融框架，以发现与无进展生存期（PFS）最相关的生物标志物。保留的模型在包含1523例患者的7个外部队列中通过Cox回归进行了验证。接下来，他们利用粪便微量元素分析、宏基因组学、免疫组学和动物模型，探索了最佳筛选结果的生物学意义（图1）。

利用包含血浆和粪便微泡（MB）数据的综合性多队列数据库，他们分析了来自 ONCOBIOME 网络内 14 个不同队列以及两个独立外部队列（PRIMM和CheckMate-025）（图2a）的 4956 个样本（4336 个血浆样本和 620 个粪便样本）。这些队列涵盖了肺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌和皮肤癌，并采用了多种治疗策略，例如ICI联合或不联合粪菌移植（FMT）、化疗（CT）、放疗（RX）和/或酪氨酸激酶抑制剂（TKI）。他们还涵盖了从高危早期患者到晚期（III期和IV期）患者的一系列临床分期（图2a）。

他们利用由两个异质队列（IML1，NCT04567446）和立体定向消融放射治疗（SABR）（NCT02992912）组成的训练集，构建了一个预测性的低维纵向机器学习模型。IML1队列纳入了接受ICI治疗的III-IV期转移性肺癌以及晚期肾癌和膀胱癌患者，这些患者主要接受抗PD-1/PD-L1药物治疗，治疗方案包括单药治疗或联合TKI或化疗。值得注意的是，约80%的患者接受了ICI治疗作为一线治疗。该队列与SABR试验合并，SABR试验是一项II期临床试验，纳入了接受SABR联合抗PD-L1抗体治疗的IV期结直肠癌、肺癌和肾癌患者。用于验证的PANDORE 队列（NCT03212651）包括接受新辅助抗 PD-1 治疗的 III 期肌层浸润性非转移性膀胱癌患者，提供了一项独立的性能测试。

他们实施了一个基于变量重要性（VIMP）的消融框架，该框架同时考虑了统计学证据和临床约束。模型在合并的IML1-SABR队列上进行训练，并在独立的PANDORE队列（30例患者和81个样本）中进行外部验证，区分度通过受试者工作特征曲线下面积（ROC-AUC）的时间依赖性指标进行评估，该指标以6个月为时间节点（图2b）。此外，对所有迭代的VIMP分析证实，只有第152次和第153次迭代的%VIMP评分均为正值，表明每个特征都对模型的性能做出了积极贡献，并强化了基于最小描述长度（MDL）的选择标准的有效性（扩展数据图2a）。最终的MDL选择模型保留了8个预测因子（图2c-d），并在PANDORE外部验证中实现了73.1%的12个月AUC（图2e）。第153次迭代的最终特征包括两个临床特征（年龄和BMI）和六种代谢物：组氨酸、琥珀酸、肉碱、二十二碳三烯酸、十六烷二酸和肌酐，所有这些特征均对PFS的预测有积极贡献（图2d）。值得注意的是，组氨酸成为主要预测因子，在所有模型中均表现出持续较高的正向VIMP 值。在合并的 IML1-SABR 队列中，血浆组氨酸水平与不同的临床参数呈正相关，例如联合治疗方案以及性别（女性）（图2f）。为了建立基于临床参数的模型，他们仅使用临床变量（年龄、性别、BMI、肿瘤类型、治疗组和分期）训练了一个随机森林生存模型。VIMP 百分比分析确定治疗组和分期是 PFS 的最强预测特征。该临床模型在 IML1 和 SABR 队列上进行训练，并在 PANDORE 队列上进行外部验证，在验证队列中实现了 12 个月 AUC 为 80.8%。鉴于代谢特征的治疗潜力，他们进一步在多个外部队列和实验模型中验证了ML 模型（图1）。

接下来，他们根据基线时血浆组氨酸质谱值的中位数对患者进行分层，通过Kaplan-Meier (KM) 曲线对多个队列的 PFS 或总生存期 (OS) 进行单变量 Cox 回归分析，包括 IML1 和 SABR、AtezoTRIBE和 MIND-DC队列。在IML1-SABR研究中，较高的血浆组氨酸水平与延长的无进展生存期（PFS）（图3a）和总生存期（OS）相关（图3a）；在AtezoTRIBE研究中，较高的血浆组氨酸水平与更长的OS相关（图3b）；在MIND-DC研究中，较高的血浆组氨酸水平与MIND-DC队列（而非安慰剂组）的无复发生存期（RFS）改善相关（图3c）。在首个外部PRIMM队列中，纳入了III-IV期黑色素瘤患者，在ICI治疗开始前和治疗开始后不久测得的高组氨酸水平也与12个月或更长时间的PFS延长相关（图3d）。另一组外部数据集来自 III 期 CheckMate-025 试验，该试验纳入了 743 例转移性肾细胞癌 (mRCC) 患者，随机分配接受纳武利尤单抗或依维莫司治疗。采用靶向质谱法对基线、第 4 周和第 8 周采集的血浆样本进行代谢组学分析。与中危组和高危组相比，预后良好组患者的组氨酸水平显著升高，具有高度统计学意义。同样，中危组和高危组之间也观察到高度显著的差异，进一步证实了这种关联的稳健性（图3e）。此外，基线组氨酸水平具有预后价值，因为在多变量分析中，较高的基线组氨酸水平与更好的PFS（图3e）和更好的OS（图3e）显著相关。该分析将组氨酸作为连续变量或以中位数为界进行二分（图3e）。值得注意的是，基线组氨酸水平与治疗组之间在PFS和OS方面均观察到显著的交互作用。

接下来，他们分析了基线组氨酸水平在癌症诊断前高危人群中的预后价值（图3f-h）。在回顾性FLEMENGHO队列研究中，该队列包含97名诊断患有动脉粥样硬化性心血管疾病并接受烟草相关癌症发病率监测的个体，较高的组氨酸水平往往与癌症发生风险降低相关（图3f）。与此趋势相符的是，在另外两个吸烟者队列中，基线高组氨酸水平与烟草相关癌症的发生或死亡风险降低相关，这两个队列要么已经发生过急性心血管事件（PREVALUNG），要么具有较高的心血管疾病死亡风险（ROBINSCA）（图3g-h）。

组氨酸是一种必需氨基酸，对炎症、能量消耗和脑神经保护等多种方面具有广泛的影响。为了阐明组氨酸再循环与ICI免疫刺激潜能之间的因果关系，他们对癌症患者进行了免疫表型分析，并在荷瘤小鼠中进行了基于L-组氨酸的饮食干预（图1）。首先，对290份纵向血液样本进行了基于40和37个标记物的流式细胞分析，以分析两组不同的癌症患者（未治疗组（IML1）和接受FMT治疗组（MIMic-FMT-LUMINate）外周血单核细胞的表型随时间的变化，同时考虑到口服组氨酸可由肠道菌群代谢。通过分析两组的共性，他们发现癌症患者循环中的组氨酸水平与表达 IL-2Ra/CD25 的活化 CD4+ T 细胞、1 型辅助性 T 细胞 ( Th1)（CXCR3）和滤泡辅助性 T 细胞 ( Th2 )（CXCR5）呈正相关，也与 CCR6+ B 细胞和非经典单核细胞呈正相关。此外，血清组氨酸浓度较高的患者血液中双阳性 T 细胞（TCR 激活的标志）的比例也升高。为了证明组氨酸在有或没有基于 ICI 的疗法的情况下具有直接的免疫刺激特性，他们转向了纤维肉瘤 (MCA205) 和黑色素瘤 (RET) 的原位临床前模型（图1）。

在治疗实验中，8周龄雌性C57BL/6J小鼠在肿瘤植入后、免疫治疗前，通过灌胃给予L-组氨酸，并隔日给药一次。组氨酸的给药剂量为0.1或1g/kg，并与抗PD-1单克隆抗体（MCA205）或抗CTLA-4联合抗PD-1单克隆抗体（RET）联合使用。口服补充组氨酸倾向于加速免疫治疗介导的纤维肉瘤（无论低剂量还是高剂量）的排斥反应（图4a-c），以及RET黑色素瘤（图4d-f）的排斥反应，尤其是在最高剂量下。在预防性治疗中，于肿瘤植入前通过饮用水给予组氨酸，结果显示，两种给药方案均能延缓MCA205肿瘤的建立并降低其侵袭性，且高剂量组的效果更为显著（图4g-i）。采用基于靶向质谱的代谢组学方法，纵向检测了口服组氨酸在血浆和粪便中的药代动力学，并在肿瘤床（图4j-m）和回肠中分别检测了组氨酸摄取15天和18天后的代谢情况。他们观察到，在高剂量组摄取15天和18天后，循环组氨酸水平呈上升趋势并显著升高（图4k）。两种剂量下，肿瘤床的代谢谱在第8天均发生改变（图4j），不仅组氨酸相对增加（图4l），而且顺式和反式尿刊酸、肌肽、组胺和3-甲基组氨酸的含量也有所增加，尽管差异不显著（图4j）。值得注意的是，粪便中组氨酸的水平与肿瘤内组氨酸的浓度呈负相关（图4m）。此外，补充组氨酸显著增加了回肠内容物中组氨酸及其代谢产物组胺和咪唑丙酸酯（ImP）的含量。此外，粪便和回肠中组氨酸浓度呈负相关，这与其直接吸收相符。代谢组学分析显示，组氨酸补充剂作为一种脱靶效应，分别降低了肿瘤组织中腺苷单磷酸和色氨酸的浓度，而这两种代谢物分别与免疫抑制和免疫刺激潜能相关。因此，口服组氨酸后，血浆和肿瘤组织中组氨酸浓度均出现剂量非依赖性升高，这可能调节淋巴细胞功能。

因此，接下来他们对接受全身性PD-1阻断治疗（单独或联合L-组氨酸）的MCA205荷瘤小鼠的肿瘤浸润CD45+白细胞、肿瘤引流淋巴结（tdLN）和脾细胞进行了流式细胞分析（图4n-o）。首先，L-组氨酸在两种剂量水平下均能诱导tdLN中前效应CD8+ T细胞（CD44- CD62L-）增殖（图4n），并在高剂量下诱导肿瘤内前效应CD8+T细胞（图4o）增殖，这些细胞表达LAG3（图4o），并分化为ICOS+ 4-1BB+ CD44+ CD62L-效应CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。L-组氨酸还促进了表达ICOS但不表达4-1BB的CD44− CD62L− CD4+ TIL的增殖潜能。其次，L-组氨酸促进了表达PD-1的pT H 17脾细胞的积累，并增加了脾脏中表达α4β7肠道归巢标志物的嗜肠CD8 + T细胞亚群，同时减少了tdLN中α4β7+调节性CD4+ T细胞的数量。

已知前效应CD8+ T细胞的代谢适应性和CD8+ T细胞细胞毒性依赖于一碳代谢。这些所谓的P4 CD8+ T细胞会下调一碳代谢相关基因的转录，并表现出线粒体呼吸作用的改变。因此，他们分析了组氨酸对小鼠初始CD8+ T细胞基础呼吸能力和储备呼吸能力的影响。利用Seahorse细胞外通量分析，他们检测了在低营养、允许脂肪酸氧化（FAO）的培养条件下培养的活化幼稚（CD44low）CD8+ T细胞的耗氧率（OCR）。组氨酸显著提高了线粒体呼吸作用，表明氧化代谢增强。依托莫西（一种CPT1a抑制剂）可消除OCR的增加，表明组氨酸诱导的代谢效应依赖于FAO（图4p）。这些数据共同表明，FAO是组氨酸增强CD8+ T细胞线粒体能量产生的关键途径。与功能适应性的提高相一致，组氨酸在体外重复刺激耗竭模型中增强了CD8+ T细胞的性能。在从第2天开始重复TCR激活且无共刺激的情况下，经组氨酸处理的幼稚CD8+ T细胞的累积扩增倍数随时间显著增加，表明其增殖能力得以保留，并能抵抗耗竭相关的功能障碍。

膳食组氨酸经肝脏和肠道菌群代谢为多种生物活性代谢物（图5a）。接下来，他们利用两个独立队列的食物问卷，研究了患者饮食习惯与基线血浆组氨酸水平之间的关联（图1）。这两个队列分别是加拿大前瞻性营养研究 BIOBANK IO 队列（纳入 147 例符合免疫检查点抑制剂治疗条件的肺癌患者和法国 PREVALUNG 队列（纳入有吸烟相关癌症风险的患者）。加拿大患者的饮食摄入量在基线时使用先前发表的简式食物频率问卷 (FFQ)的改良版进行评估。该问卷包含 47 种食物，每种食物均有标准化的份量和频率等级，范围从每周 0 次到 5 次以上。该问卷由一位训练有素的营养师设计并实施，以确保患者对份量和频率类别的理解保持一致。随后，使用经过验证的营养素计算工具计算营养素摄入量，从而得出以克为单位的每日营养素摄入量（图5b）。摄入的组氨酸对应于富含蛋白质的食物（鱼、肉、蛋，通常每周至少食用 3-4 次）。他们首先分析了组氨酸摄入量对 PFS 的影响（图5c）。为此，根据组氨酸摄入量中位数（以每日总热量摄入量标准化，即每1000千卡摄入1.25克）将147例肺癌患者队列进行分组。单因素和多因素Cox逻辑回归分析显示，组氨酸摄入量≥1.25克/1000千卡/天与PFS延长相关；然而，本研究中血浆组氨酸水平与PFS或OS均无相关性。为了探究为何组氨酸摄入量而非血浆组氨酸水平与PFS相关，他们分析了通过质谱法测定的粪便组氨酸代谢物谱（图5a），并探讨了其与通过宏基因组分析的粪便分类组成之间的相关性。粪便组氨酸水平与有利微生物群的 MGS 指数呈正相关，而血浆组氨酸水平与 S 评分呈正相关，该评分此前报道与 ICI 的临床获益相关（图5d-e）；然而，肠道菌群失调与血浆中免疫抑制性组氨酸终产物ImP水平升高相关（图5d-e）。事实上，血浆和粪便中的ImP水平呈正相关，且血浆ImP/粪便组氨酸比值与S评分呈负相关，表明肠道菌群失调影响组氨酸的再循环（图S7a-c）。实际上，粪便中反式尿刊酸/ImP和ImP/组氨酸比值的中位数分别与临床结局呈正相关和负相关（图5f）。此外，血浆中反式尿刊酸/组氨酸比值与 PFS 呈负相关（图5g）。

本研究采用靶向代谢组学和宏基因组学方法，对来自欧洲和北美16个队列、涵盖五种肿瘤类型的1714例患者的4336份血浆样本进行了分析。这些样本在五种基于ICI的治疗方案（包括粪便微生物移植）期间进行了纵向采样。本研究构建了一个多模态机器学习框架，整合了154种代谢物和临床变量，最终确定了五种代谢物、年龄、体重指数和肾功能可作为12个月无进展生存期的预测因子。该模型在包含105例和30例患者的训练队列中AUC分别为0.88和0.73，并成功推广至七个外部队列。组氨酸是预后良好的特征，而长链脂肪酸和琥珀酸则与预后呈负相关。组氨酸补充剂增强了小鼠的抗肿瘤免疫力。富含组氨酸的饮食改善了缺乏与组氨酸分解代谢相关的肠道菌群失调特征的患者的无进展生存期。