文献解读|Mol Cancer（33.5）：定量蛋白质组学分析揭示了VARS1通过调控MAGI1表达在肝细胞癌侵袭性中发挥的关键作用

肝细胞癌（HCC）是最常见的肝癌类型。HCC的发生发展主要与潜在的慢性肝病有关，例如乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染、过量饮酒或代谢功能障碍相关性脂肪肝（MASLD）。尽管HBV/HCV相关HCC的发病率最高，但MASLD相关HCC的病例增长速度超过其他病因，预计在未来几年将成为HCC的主要病因。本研究旨在通过对一组特征明确、病因均衡的HCC患者队列的亚细胞分级肝脏样本进行非靶向定量蛋白质组学分析，深入了解HCC的蛋白质组组成和动态变化。

研究团队对来自 42 例肝细胞癌 (HCC) 患者和 5 例健康肝组织的肿瘤组织 (T) 和癌旁正常组织 (NTAT) 的胞质和核组分进行定量蛋白质组学分析 (SWATH-MS)（图 1A）。结果在胞质组分中鉴定出 1532 种蛋白质，在核中鉴定出 2102 种蛋白质；其中 313 种蛋白质在两个组分中均有表达（图 1B ）。通过免疫印迹法，使用组分特异性标记物（NTAT）验证了亚细胞组分分离。通过非监督层次聚类分析，NTAT的蛋白质与健康肝组织的蛋白质相当，因为没有观察到差异聚类，因此表明 NTAT 代表了 NTAT 与肿瘤配对比较的可靠、健康的对照。相比之下，HCC样本的蛋白质组与NTAT样本相比发生了显著改变，其中524种蛋白质（34.2%） 在胞质组分中的丰度 存在显著差异（ p < 0.05），1013种蛋白质（48.2%）在核组分中的丰度存在显著差异（图1 B-C）。主成分分析（PCA）进一步证实了HCC蛋白质组的显著失调，基于核蛋白质组，HCC样本与NTAT样本之间存在明显差异，且胞质蛋白质组的变异性更高。

胞质HCC蛋白质组的特征是代谢通路（碳水化合物、脂质和氨基酸代谢）的改变，以及细胞运动（整合素信号通路改变）和mRNA/蛋白质代谢[无义介导衰变（NMD）、蛋白质折叠]的改变（图 1D）。使用IPA软件（该软件可预测细胞通路的激活/抑制）进行的进一步分析证实了LXR/RXR信号通路的激活和外源性物质代谢的普遍失活。核HCC蛋白质组的特征是基因表达过程（RNA聚合酶、转录终止）、RNA代谢（mRNA剪接、tRNA氨酰化）、蛋白质稳态相关细胞功能[未折叠蛋白反应（UPR）、IRE1α和Xbp1信号通路]以及线粒体损伤相关通路的改变（图 1E）。在这种情况下，IPA 分析显示剪接体和 sirtuin 信号传导激活，同时氧化磷酸化和降解过程失活。

为了探究基于胞质或核蛋白质组特征的HCC亚型是否存在，他们对HCC和NTAT样本进行了无监督层次聚类分析。结果显示，胞质和核蛋白质组均定义了两个HCC亚组（PR1和PR2），这两个亚组与NTAT样本明显不同（图 2A-B）。大多数患者在胞质和核蛋白质组特征分析中均归为同一亚组。PR1和PR2亚组具有特定的胞质和核蛋白聚类，并以此进行分子表征。具体而言，PR1样本的胞质蛋白质组富含Cyto3聚类蛋白，核蛋白质组富含Nuc2聚类蛋白，这些蛋白均与急性期反应、LXR和FXR信号通路相关，这与部分保留肝脏特征的亚组相符。另一方面，PR2样本的特征是Cyto4和Nuc4聚类的过表达，这些聚类富集于EIF2、mTOR、剪接体或DNA修复等癌症相关通路，以及其他一些研究较少的通路，例如tRNA氨酰化。PR1和PR2亚组的患者也具有不同的临床特征。PR2亚组的患者预后更差（即肿瘤更大、生存期更短、复发率更高且去分化程度更高）。虽然PR1和PR2之间的病因分布没有统计学差异，但所有MASLD来源的HCC患者均纳入PR2。因此，蛋白质组学上的PR1亚组可能与低侵袭性HCC相关，且肝功能保持良好，而PR2则代表一种高侵袭性/预后不良的HCC亚型。

这些蛋白质组定义的亚类与先前定义的HCC分子亚类相关，基因集富集分析（GSEA）比较了两个亚组的胞质和核蛋白质组，证实了这一点。具体而言，PR2胞质蛋白质组在定义Boyault G12和G3聚类的基因集中富集，而Chiang提出的CTNNB1亚组中下调的基因则获得了负的NES评分。类似地，PR2核蛋白质组在定义Boyault G3和Hoshida S2亚类的基因集中富集，而PR1核蛋白质组在未注释亚类的基因集中富集。因此，PR1与非增殖性HCC亚类具有共同特征，而PR2的分子特征与增殖性亚类相符。

转运RNA（tRNA）氨酰化是由氨酰tRNA合成酶（ARS）催化的关键生物学过程，在HCC中研究较少。与正常组织（NTAT）相比，HCC蛋白质组中tRNA氨酰化是最显著改变的特征之一；与增殖样亚类（PR2）相比，PR2蛋白质组中tRNA氨酰化的特征也最为显著。在检测到的17种ARS中，DARS1、EPRS1、NARS1和VARS1在HCC样本的胞质组分中表达上调。在核组分中，DARS1、FARSA、FARSB、NARS1、VARS1和WARS1表达上调，而EPRS1和RARS1表达下调（图 3A）。胞质组分中的VARS1和NARS1以及核组分中的FARSB在区分HCC和NTAT样本方面具有最高的鉴别能力（图 3A）。在其他已有的计算机模拟HCC队列中，进一步证实了ARS在HCC中的表达失调（图 3B）。在6个mRNA队列中的5个以及蛋白质队列（CPTAC-Zhou）中，VARS1和EPRS1均持续过表达；而NARS1、DARS1和FARSA在超过3个mRNA队列以及CPTAC-Zhou队列中过表达。此外，在4个队列中，VARS1是区分HCC与对照组能力最强的前3个基因之一（图 3C）。

根据ARS家族的表达水平（高、中、低表达），将患者分为三组（胞质和核蛋白质组学队列、TCGA-LIHC（mRNA）队列和CPTAC-Zhou（蛋白质）队列），并评估不同队列的临床特征，结果表明ARS家族的总体失调具有预后价值。胞质ARS丰度高的患者生存率显著降低，复发率显著升高（图 3E）。高ARS表达患者的分子指纹图谱富集Boyault G123基因集，而低ARS表达患者则富集Hoshida S3和Boyault G6亚聚类（图 3F）。核蛋白质组学分析、CPTAC-Zhou 蛋白队列和 TCGA-LIHC 队列也获得了类似的结果。TCGA-LIHC 队列还揭示了高 ARS 亚组与增殖性 HCC 亚类中常见突变基因（例如TP53、ARID1/A、TSC1/2）突变频率较高之间的关联。更深入的分子分析表明，高 ARS 亚组与蛋白质稳态[未折叠蛋白反应 (UPR)]、mRNA 代谢或运动通路改变相关。此外，典型的间质标志物（例如 YWHAZ、YWHAE、ACTN4 等）表达增加，而肝细胞标志物表达下调。在高ARS亚组中检测到了某些标志物（例如ALB、APOB、SERPINA1等）。这些结果证实了ARS家族在侵袭性/增殖性和未分化HCC样本中的上调。

基于这些结果，缬氨酸tRNA合成酶（VARS1）在肝细胞癌（HCC）中表现出最显著的改变。事实上，与正常组织相比，HCC样本的胞质和核组分中VARS1蛋白水平均上调，且这种上调在CPTAC蛋白队列和另外5个mRNA队列中得到证实（图 4A）。他们使用回顾性研究2队列（蛋白验证队列）中的部分样本，通过Western Blot实验证实了HCC中VARS1蛋白丰度的增加（图 4B）。值得注意的是，与原发肿瘤相比，HCC来源的肾上腺和肺转移灶中 VARS1的表达水平也更高（图4A）。此外，较高的VARS1胞质蛋白丰度与较大的肿瘤、微浸润和低分化程度显著相关；而较高的VARS1核蛋白丰度与门静脉高压显著相关。最后，在胞质蛋白质组学队列和计算机模拟 TCGA-LIHC 队列中，VARS1 高表达的患者均表现出较低的生存率和较高的复发率（图 4 C-D）。

通过在两种侵袭性不同的HCC细胞系中过表达（质粒）和沉默（两种siRNA）来评估VARS1的功能后果。VARS1过表达对Hep3B和SNU-387细胞的增殖或迁移没有显著影响，而VARS1沉默则轻微但显著地降低了两种细胞系的增殖和迁移。相反，VARS1过表达显著增加了肿瘤球的大小和克隆形成，而VARS1沉默则观察到相反的效果（图 4E），这表明VARS1在间质转化（EMT）和肿瘤形成中发挥着更重要的作用。事实上，VARS1沉默与上皮相关黏附分子（CDH2和ZO-1）的普遍上调以及 RAC-RHO 轴的下调相关，而干性/祖细胞标志物大多未发生改变。与此一致的是，VARS1过表达调节了一些 EMT 和干性/祖细胞标志物的表达，包括 Ras 同源物家族成员 A (RHOA) 和 B (RHOB)、MET 原癌基因以及 Thy-1 细胞表面抗原 (THY1)。

VARS1参与肿瘤形成的作用已通过两种体内实验方法得到证实。首先，他们进行了体内极限稀释实验（ELDA），结果表明，在所测试的三种细胞浓度（100万、10万和1万个细胞/侧腹部）下，VARS1过表达细胞形成的皮下肿瘤均大于对照细胞（图 5 A-B）。当皮下注射较低浓度的细胞时，肿瘤体积/重量和肿瘤数量的差异更为显著，而此时对照细胞形成的肿瘤很小或没有肿瘤。其次，使用过表达VARS1和表达荧光素酶的 Hep3B 细胞建立了原位 HCC 模型，证实了在具有挑战性的条件下（注射亚最佳浓度的细胞），过表达VARS1 的细胞更容易启动肿瘤形成并促进肿瘤更快生长（图 5 C-D）。

为了进一步阐明VARS1过表达的分子后果，他们对过表达VARS1的Hep3B和SNU-387细胞系进行了非靶向定量蛋白质组学分析。原始数据见补充数据2C。VARS1过表达改变了Hep3B细胞中257种蛋白质的表达，改变了SNU-387细胞中348种蛋白质的表达（图 6A）。在两种细胞系中，这些变化均与常见的细胞过程相关，例如mRNA代谢、SUMO化和RHO GTP酶循环。有趣的是，还存在其他细胞系特异性改变，包括Hep3B细胞中凋亡调控蛋白的减少以及SNU-387细胞中炎症小体优势的转变（图 6B）。值得注意的是，VARS1过表达在两种细胞系中均诱导了20种共同蛋白质的改变。这些改变的蛋白质中，大多数的缬氨酸含量以中位数为中心，表明不存在对富含缬氨酸蛋白质的偏好。此外，与TCGA-LIHC队列的对照肝组织相比，HCC肿瘤中缬氨酸-tRNA（VARS1的底物）普遍下调，其中30个缬氨酸-tRNA中仅有5个与肿瘤组织中VARS1的表达呈显著负相关。这些数据表明，VARS1的过表达并未伴随将缬氨酸掺入新生蛋白质的tRNA表达的增加，提示VARS1在HCC中具有不依赖于缬氨酸的作用。

在这20种常见的改变蛋白中，MAGI1、EBNA1BP2、IDE和MFSD10在两种细胞系中均表现出一致的改变（表达上调或下调）（图 6C）。其中，MAGI1是HCC中的抑癌基因，其表达水平在三个不同的HCC队列中均与VARS1的表达呈负相关（图 6D）。体外实验表明，VARS1沉默可诱导MAGI1 mRNA和蛋白表达上调，而VARS1过表达则可诱导两种细胞系中MAGI1 mRNA和蛋白表达下调（图 6E-F）。

MAGI1 最初在HCC患者队列中发现，研究证实其在 HCC 样本中的表达显著低于对照组（图 7A）。在细胞系中过表达MAGI1可降低细胞增殖，尤其是在 SNU-387 细胞系中。此外，两种细胞模型中集落和肿瘤球的形成均减少了至少 50%（图 7B），这证实 MAGI1 也参与干细胞特性维持和肿瘤发生，正如 VARS1 所观察到的那样。为了评估MAGI1下调是否是VARS1促进侵袭性所必需的，他们进行了同时过表达VARS1和MAGI1的挽救实验（图 7C）。结果表明，在两种细胞系中， VARS1过表达诱导的克隆形成和肿瘤球形成均受到MAGI1过表达所抑制（图 7D），证实了VARS1过表达在HCC中的作用是通过MAGI1介导的。

定量蛋白质组学揭示了HCC中胞质和核蛋白质组的失调，并定义了两个蛋白质组学HCC亚组，其中最具侵袭性的亚组与ARS的失调相关。计算机模拟的HCC队列证实了ARS的失调，且ARS失调与不良预后相关。ARS上调的患者具有增殖性HCC的基因组/转录组特征。VARS1是表达最稳定且与侵袭性相关的ARS。VARS1的调控（沉默/过表达）在体外和/或体内均改变了肿瘤建立相关的参数。对过表达VARS1 的细胞进行定量蛋白质组学分析和拯救实验发现，HCC 中的肿瘤抑制因子MAGI1的下调是 VARS1 功能的介质。