文献解读|Nat Cancer（28.5）：IDH突变型星形细胞瘤的进化轨迹揭示了与细胞周期相关的分子分级标志物

成人型弥漫性胶质瘤是最常见的恶性脑肿瘤，其组织学特征是广泛浸润性，目前尚无治愈方法。世界卫生组织第五版中枢神经系统（CNS）肿瘤分类（WHO CNS5）将这些胶质瘤分为 IDH 野生型胶质母细胞瘤和 IDH 突变型星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。虽然分子特征分析极大地增进了大众对弥漫性胶质瘤的理解，但驱动恶性进展的机制仍然知之甚少。

研究团队筛选出111例在1989年至2019年间接受手术治疗的患者，这些患者最初诊断为IDH突变型2-4级星形细胞瘤（WHO CNS5）。最终的GLASS-NL数据集包含105例患者的匹配的初治和复发多组学数据（图1a）；诊断时的中位年龄为32.0岁，低于2级和3级IDH突变型星形细胞瘤的平均年龄（分别为45岁和52岁），也低于验证队列的平均年龄（CATNON队列为42.2岁，TCGA队列为36.7岁）。该队列的治疗方案并不统一，部分患者在未接受手术干预的情况下，因肿瘤进展而接受了额外的治疗（即放疗和/或化疗）。在首次手术切除前，6例患者接受了活检，其中2例接受了额外的治疗。在疾病进展过程中，95 名患者接受了除手术切除以外的任何类型的治疗。

初发肿瘤和复发肿瘤的肿瘤纯度相似（图1b）。肿瘤内异质性由染色体拷贝数异质性（CNH）确定，染色体不稳定性由臂水平非整倍体评分（AS）和总拷贝数变异负荷（CNVL）确定。CNH、AS和CNVL在肿瘤复发时均显著升高（图1c-e）。复发肿瘤中高CNH与PRS呈负相关，初发肿瘤中高AS与OS呈负相关，复发肿瘤中高AS也与PRS呈负相关。初发肿瘤和复发肿瘤中高CNVL也与OS呈负相关。所有基因组不稳定性指标均呈正相关（图1f），其中一部分肿瘤随着时间的推移变得更加不稳定。

多个基因组区域在复发性肿瘤中更常受到影响（图1g）。chr9p24.3-p21.2和chr10q21.3-q26.3（分别包含CDKN2A/B和PTEN基因位点）的缺失与PRS呈负相关。根据Wilcoxon秩和检验，CDKN2A/B的纯合缺失（HD）与初发肿瘤和复发肿瘤中的高AS相关，并且与复发肿瘤中的高CNVL和CNH 相关。

肿瘤复发时，3例患者的IDH1突变消失，5 例患者出现PIK3CA或PIK3R1突变。配对分析显示，基因特异性突变的频率随时间变化不显著，但 Wilcoxon 符号秩检验显示，复发肿瘤的总突变数显著高于非复发肿瘤（图1h）。

IDH1/2杂合突变是IDH突变型胶质瘤中最早出现的基因改变之一，由于其对TET介导的DNA去甲基化的间接抑制作用，IDH突变型胶质瘤通常表现出高甲基化表型。他们发现，随着时间的推移，全基因组DNA甲基化水平趋于下降，许多甲基化位点（即CpG位点）在复发肿瘤中显示出显著降低的DNA甲基化水平（图2a）。为了探究DNA去甲基化的时间性机制，他们鉴定了初治肿瘤和复发肿瘤之间的差异甲基化区域（DMR）。两个染色体区域（chr6p22.2-p21.2 和 chr11q12.2-q13.5）显著富集DMR，其中一些区域还具有高度显著性（图2b）。这表明，在复发性肿瘤中，这些位点的 DNA 甲基化发生特异性地解除，这可能允许靶基因的转录。chr6p22.2-p21.2 启动子区域的DMR与核小体、DNA 包装和染色质组装相关（图2c）。

在初治肿瘤和复发肿瘤之间差异最大的1389个甲基化位点（DMP）在主成分分析（PCA）中并未区分初治肿瘤和复发肿瘤，而是在第一主成分（PC1）上呈现出梯度，且与该CpG位点集的中位M值呈显著负相关（图2d-e）。这表明肿瘤样本之间的大部分差异可由肿瘤样本DNA甲基化的中位水平解释。此外，他们发现复发性肿瘤（而非初发肿瘤）中这些差异甲基化位点（DMP）的中位M值与总生存期（OS）和多基因风险评分（PRS）密切相关，M值越高，预后越好。因此，他们将该CpG位点集的中位M值定义为每个样本的“胶质瘤甲基化特征”（GMS）评分。值得注意的是，他们发现该特征的方法与基于“标准分类器”（例如logistic lasso回归）的方法有所不同，原因有二：(1) 本研究采用的是配对样本而非独立样本；(2)本研究倾向于使用简单易懂的评分，而非通常由此类分类器生成的复杂评分。

根据 GMS 评分对所有样本进行排序显示，初治肿瘤大多聚集在该谱系的高甲基化端，而复发肿瘤则更多地集中在低甲基化端（图2f）。为了揭示驱动 DNA 去甲基化的机制，他们研究了已知的进展分子标志物（CDKN2A/B HD、CDK4扩增、PDGFRA扩增、RB1 HD 和/或 PI3K 突变）之间的关联。低GMS评分与这些标志物中的任何一种都相关，即使排除仅携带CDKN2A/B HD的病例后，这种相关性仍然存在，Wilcoxon秩和检验结果也证实了这一点。他们使用多重回归模型检验了各个进展标志物对初治肿瘤和复发肿瘤GMS评分的影响及其两两交互作用。CDKN2A/B HD 对 GMS 评分在两个模型中均有显著的主效应，而RB1 HD 和PDGFRA扩增分别在初治模型和复发模型中对 GMS 评分有显著的主效应。由于统计效能较低，无法估计部分交互作用的影响，但所有交互作用项均不显著。综上所述，这些结果表明所研究的基因改变与观察到的 DNA 去甲基化时间相关。

复发肿瘤的GMS评分与生存率呈线性相关；然而，为了便于日常临床实践应用，他们将样本分为三个GMS等级。与高GMS等级相比，复发肿瘤中的低GMS等级与PRS呈负相关（图2g）。在初治肿瘤中，未能发现总生存期（OS）与GMS分级之间存在显著相关性，但这可能是由于样本量较小以及GLASS-NL队列的选择偏倚（倾向于选择适合接受二次手术的患者）。多因素分析显示，低GMS分级的预后价值独立于已知的临床预后因素（年龄、性别和体能状态）、切除范围、治疗（放疗和/或化疗）以及肿瘤分级（WHO CNS5）（图2h）。因此，GMS分级可视为IDH突变型星形细胞瘤的辅助分级工具。

他们进一步发现GMS分类与肿瘤分级之间存在相关性，高GMS分类的肿瘤主要为2级，而低GMS分类的肿瘤则主要为4级（图2i）。然而，联合生存分析表明，GMS分类在肿瘤分级之外还具有额外的价值。肿瘤分级的差异解释了观察到的大部分时间性DNA去甲基化现象，因为复发为4级的肿瘤表现出全基因组DNA甲基化水平显著降低，而复发为2级和3级的肿瘤的DNA甲基化时间变化则较为有限（图2j）。在4级稳定肿瘤中也观察到了类似的DNA甲基化水平的微小但仍然显著的降低。因此，肿瘤复发时肿瘤分级的总体升高似乎与这种时间性DNA去甲基化有关。

为了验证 GMS 是否也对新诊断的 IDH 突变型星形细胞瘤患者具有预后价值，他们使用了来自随机 3 期 CATNON 临床试验 12,13 中 432 名参与者的 DNA 甲基化数据。在该数据集中，肿瘤样本也可以根据每个样本的 GMS 评分逐步分离（图3a），该评分也与恶性标志物的存在密切相关（图3b）。较低的 GMS 等级 与OS呈负相关，与无进展生存期 (PFS) 也呈负相关（图3c，图S3a）。在多变量分析中，低GMS和中GMS分级患者的预后不良与已知的临床预后因素、切除范围、附加治疗以及CDKN2A/B HD无关（图3d）。在本组组织学分级为III级的肿瘤（根据WHO CNS4分级标准纳入试验）中，GMS分级也具有独立于肿瘤分级的预后价值。综上所述，这在一个独立的数据集中验证了GMS的预后价值，进一步强化了其可作为IDH突变型星形细胞瘤分级辅助工具的观点。

为了进一步验证预后价值，他们对TCGA队列4中包含的IDH突变型星形细胞瘤样本进行了类似的分析。虽然该数据集的临床注释较为有限，但用于定义GMS分类的临界值在该队列中也显示出较强的预后价值（图S3b）。在TCGA数据集中，GMS分类比肿瘤分级具有独立的预后能力（图S3c-e）。

5-甲基胞嘧啶 (5mC) 向 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) 的转化是主动 DNA 去甲基化的第一步，由 TET 酶介导。他们使用公开数据集分析了 IDH 突变型胶质瘤中的 5-hmC 水平，并筛选了高GMS和低GMS 样本之间的差异，发现5-hmC 的β值普遍较低。事实上，5-hmC 对所有CpG位点β值的贡献率为 6.8% ± 5.5%，而对 GMS 的 1389 个 CpG 位点的贡献率仅为 3.9% ± 3.6%。此外，在比较 GMS 得分高低不同的样本时，未能发现任何差异羟甲基化的 CpG 位点（图S3f-g）。

为了研究转录组的时间变化，他们对初治肿瘤样本和复发肿瘤样本进行了差异表达分析，并鉴定出604个差异表达基因（DEG）。一部分上调的DEG集中在6p22.2-21.33染色体区域，该区域与富含低甲基化DMR的区域重叠（图4a）。该位点上的基因主要为组蛋白基因，编码参与组蛋白复合物形成以及核小体形成和DNA包装的蛋白质。对所有604个DEGs进行共表达聚类分析，结果显示存在四个基因聚类，其中三个代表复发时上调的基因，一个代表下调的基因（C1-C4）（图4b）。为了揭示这些转录变化所涉及的过程，他们研究了这些基因聚类的关联性及其细胞类型特异性表达。他们对 GLASS-NL 队列中三对匹配肿瘤的样本进行了单细胞核转录组分析(snRNA-seq)，并用来自三个独立的 IDH 突变星形细胞瘤数据集的单细胞转录组分析 (scRNA-seq) 数据补充了这些数据。值得注意的是，所有三名 GLASS-NL 患者的复发肿瘤均选择为 4 级。

上调的C1主要以胶原蛋白为特征，其基因表达与肿瘤纯度呈负相关（图4b）。这些基因主要由周细胞表达，通路富集分析显示其与细胞外基质相关（图4c-d）。该基因聚类与IDH野生型胶质母细胞瘤中鉴定的一个表达聚类高度重叠，后者的基因也呈时间上调，并由周细胞表达。这表明IDH突变型星形细胞瘤和IDH野生型胶质母细胞瘤均采用类似的机制来修饰细胞外基质，从而增强肿瘤恶性程度。然而，由于C1基因也由一个（未确定的）肿瘤细胞聚类表达，他们不能排除肿瘤细胞在低纯度环境下，复发时会增加这些标志物表达的可能性。C2包含了chr6p22.2-21.33组蛋白基因座上调的所有基因，并进一步富集了用于定义细胞周期的基因，包括TOP2A。因此，通路富集分析揭示了其与细胞周期过程和染色体组织相关的通路（图4e）。C2的表达主要来源于肿瘤细胞，因为基因表达与肿瘤纯度密切相关，且这些基因主要由细胞周期肿瘤细胞表达（图4c）。C3中的基因显示出较低的聚类间相关性，且未发现富集的细胞类型；通路富集分析主要揭示了其与发育相关基因集的关联，但关联强度并不强（图4f）。下调的C4包含成熟星形胶质细胞的标记物，包括GABRG1，并且发现的少数富集通路均与纤毛相关（图4g）。这些基因主要由星形胶质细胞和星形胶质细胞样肿瘤细胞表达（图4c），观察到的表达随时间的变化可能源于两者之一。总之，他们发现星形胶质细胞样肿瘤细胞的比例随时间推移而降低，而分裂肿瘤细胞的比例则增加，从而导致了观察到的表达差异。

为了验证C1-C4表达的时间差异，他们整合了三对肿瘤样本的snRNA-seq数据（图5a）。所有肿瘤样本的细胞均显示出明显的重叠，并且涵盖了肿瘤微环境中所有预期的主要细胞类型。所有基因聚类均显示出不同的（时间）表达模式（图5b）。更具体地说，C2基因在复发肿瘤的增殖性肿瘤细胞中富集，C3基因主要由未分化为寡聚体样或星形胶质细胞样肿瘤细胞状态的复发肿瘤细胞表达，而C4基因在初治肿瘤的星形胶质细胞样肿瘤细胞中富集。C3的表达上调和C4的表达下调共同表明肿瘤细胞随时间的去分化。此外，在所有三例高级别复发患者中，C2和C4的表达时间变化均保持一致（图5c）。

由于所有三对snRNA肿瘤在复发时均表现出恶性转化，他们采用包含其他协变量的多变量模型评估了肿瘤分级对表达的影响（图6a）。肿瘤分级对C2和C4的影响强于时间（初治-复发）效应。这表明C2基因的时间上调和C4基因的下调源于复发时高级别肿瘤比例的增加。他们将每个聚类的基因表达汇总为每个样本的聚类值，并将样本分为高表达组和低表达组，发现C2高表达病例主要为4级（33/54，61.1%），而C4高表达病例主要为2级（62/84，73.8%）（图5d）。此外，他们发现复发肿瘤中C1和C2的高表达以及C4的低表达与生存率呈负相关（图5e）；使用连续聚类值时也观察到了类似的预后价值。C3的表达与生存率无关。

细胞周期相关基因的上调也反映在蛋白质表达数据中。非配对差异蛋白表达分析表明，低级别和高级别肿瘤样本之间有80种蛋白质的表达存在显著差异（图5f）。高级别肿瘤中许多上调的蛋白质都参与细胞周期，包括增殖细胞核抗原（PCNA）和微染色体维持复合物组分7（MCM7），这进一步支持了在复发为4级IDH突变型星形细胞瘤的肿瘤中细胞周期活跃的观点。虽然未在初治肿瘤和复发肿瘤之间发现差异表达蛋白（DEP），但这可能与可用的匹配肿瘤样本数量较少有关。由于每个样本的DNA甲基化特征评分降低和细胞周期基因上调均与高级别复发和不良生存率相关，他们检测了这两个标志物之间的相关性。他们发现C2聚类值和GMS评分呈负相关，表明细胞周期上调与DNA去甲基化的时间性变化相关，尤其是在复发性IDH突变星形细胞瘤中（图5g）。

利用上述多元模型，他们评估了额外治疗对基因表达聚类的影响（图6a）。虽然C1的治疗系数高于 C2-C4，但这些系数并未超过与治疗无关的协变量的系数，且多元校正后的P值也不显著。虽然这些数据表明治疗并非观察到的转录组时间变化的主要驱动因素，但由于本分析的统计效力有限（约25%的患者接受了替莫唑胺治疗）以及本研究的回顾性性质，无法得出明确的结论。

同样，他们使用混合效应模型检验了治疗是否会对DNA甲基化产生混杂效应，并旨在识别治疗组和未治疗组患者之间的DMP。然而，在评估的656517个CpG位点中，仅有13个在接受放疗和化疗的患者与两次手术干预之间未接受任何治疗的患者之间存在差异甲基化，使用其他分层方法也未能发现更多DMP。因此，治疗对DNA甲基化时间变化的影响并未导致该队列中观察到的时间性DNA去甲基化。与复发手术前未接受治疗的患者相比，接受治疗的患者复发肿瘤中单个CpG位点的DNA甲基化水平偏低（图6b）。然而，他们的分析表明，这种效应并非由治疗本身引起，而是由治疗组患者中更常见的高级别复发所致（图6c）。

本研究对105例患者的匹配的初治和复发肿瘤样本进行了多组学分析，并将数据与详细的临床注释相结合，发现了与恶性进展相关的重叠特征，这些特征源于三种分子机制：细胞周期、肿瘤细胞（去）分化和细胞外基质重塑。这些特征共同解释了肿瘤恶性进展的潜在生物学机制。DNA甲基化水平随时间推移而降低，主要发生在发生恶性转化的肿瘤中，并且与预后不良的遗传事件同时发生。本研究发现了一种与生存期密切相关的基于DNA甲基化的特征，该特征可用于对IDH突变型星形细胞瘤进行客观的、基于分子水平的分级，从而辅助临床决策。本研究结果在大型独立的IDH突变型星形细胞瘤样本队列中得到了验证。