NC |顶尖科研团队首次系统揭示FADS在肝癌铁死亡 抵抗与CD8+ T细胞招募抑制中的双重作用

10月29日，《Nature Communications》（IF=15.7）在线发表由南京医科大学、中国医学科学院等顶尖科研团队联合完成的重磅研究成果“ FAD synthase confers ferroptosis resistance and restrains CD8+ T cell recruitment in hepatocellular carcinoma ”。研究首次系统揭示了FADS在肝癌铁死亡抵抗与CD8+ T细胞招募抑制中的双重作用，为肝癌免疫治疗提供了全新靶点。

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肝细胞癌（HCC）是全球范围内最普遍、最致命的恶性肿瘤之一，超过一半的病例在晚期才被诊断。尽管酪氨酸激酶抑制剂、抗血管生成疗法和免疫检查点抑制剂为HCC患者提供了生存获益，但耐药性经常发生，导致临床结果不尽人意。因此，迫切需要改进HCC的治疗策略。

代谢重编程是癌症的一个标志，了解失调的代谢如何促进肿瘤进展成为研究的热点。然而大多数研究集中在主要代谢途径的失调上，维生素代谢在肿瘤进展和治疗抵抗中的作用还有待进一步探索。

研究团队首先对三个HCC数据集进行分析，基于Reactome数据库定义一个VB2代谢特征基因集（SLC52A1, SLC52A2, SLC52A3, RFK, FLAD1, ACP5, 和 ENPP1），计算VB2代谢评分，据此量化代谢激活水平。与邻近肝组织相比，肿瘤中的VB2代谢评分显著更高（图1a），表明VB2代谢在HCC中明显活跃，并且具有较高VB2代谢评分的患者表现出较差的预后（图1b）。

为评估TME内不同细胞群中的VB2代谢水平，研究人员对来自免疫治疗队列的HCC活检样本做单细胞RNA测序，获得81,250个高质量细胞鉴定出七种主要细胞类型（图1c, d）。并使用InferCNV算法从上皮细胞鉴定出18,642个恶性肿瘤细胞，且肿瘤细胞拥有最高的VB2代谢评分，显著高于正常上皮细胞（图1e）。来自公共数据库的scRNA-seq数据（GSE202642）也验证了这一发现（图1f, g），随后研究团队将分析重点放在肿瘤细胞上。

图1. VB2代谢促进HCC进展

究团队接下来从代谢物和酶的角度分析VB2代谢对HCC细胞的影响（图1h）。通过细胞迁移实验、构建体外模型、敲降、过表达等实验验证VB2代谢在支持HCC细胞的恶性行为中起着关键作用。分析发现FADS在人类HCC中广泛过表达，高FLAD1表达与HCC患者对PD-1治疗抵抗和较差的预后相关。

为研究FADS在HCC进展中的作用，研究团队使用Fads敲低（shFlad1）的Hepa1-6细胞，在免疫正常的C57BL/6小鼠中建立肿瘤模型，观察发现Fads敲低显著抑制肿瘤生长。考虑到肿瘤免疫的捕食者-猎物理论，肿瘤消退可能源于肿瘤细胞脆弱性增加和抗肿瘤免疫力增强。鉴于T细胞，特别是CD8+T细胞，在抗肿瘤免疫中的关键作用，推测T细胞可能有助于肿瘤消退。

研究人员分别在免疫正常小鼠C57BL/6和免疫缺陷小鼠Rag1−/−（缺乏T和B细胞）中生成肿瘤模型，观察肿瘤消-长情况，证实T细胞在介导肿瘤消退中的重要性。鉴于巨噬细胞在肿瘤中的普遍存在，研究团队也通过施用氯膦酸盐脂质体进行巨噬细胞耗竭实验，证实巨噬细胞并未参与FADS敲低诱导的肿瘤消退。

综上所述，FADS通过支持肿瘤细胞生长和抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫力来促进HCC进展。

为全面描述FADS对TME的影响，特别是对肿瘤细胞和T细胞的影响，研究人员使用Hepa1-6细胞在C57BL/6小鼠中建立原位肿瘤，第14天收获肿瘤进行scRNA-seq（图3a）。10个样本（5个FADS敲低肿瘤 [KD] 和5个对照肿瘤 [NC]）进行单细胞测序，捕获128,884个细胞用于下游分析。无监督聚类识别出29个不同的细胞簇，利用Marker基因鉴定为15种细胞类型（图3b），同时也鉴定了恶性肿瘤细胞。

接下来重点分析肿瘤细胞，scDist分析显示，肿瘤细胞在FADS敲落后表现出最显著的扰动（图3c）。与对照相比，Fads敲低模型中肿瘤细胞Flad1表达和VB2代谢评分都更低（图3d），表明FADS的缺失损害了VB2代谢活性。差异基因KEGG富集分析显示，肿瘤细胞代谢途径显著改变，包括葡萄糖、脂质和氨基酸代谢，以及免疫相关途径；与细胞铁死亡相关途径也被富集（图3e）。

接下来研究团队又将注意力转向T细胞，对T和NK淋巴细胞重新聚类，分出16个亚群，从中鉴定出7个不同的CD8+T细胞群（图3f），分析发现其中6个（C11, C06, C05, C03, C02, C01）表现出显著的T细胞耗竭特征（图3g）。表明肿瘤内CD8+T细胞大部分处于耗竭状态，这与人类HCC的观察结果一致。FADS敲落后，CD8+T细胞亚群出现明显的扰动（图3h）。使用干扰素、功能障碍和增殖的基因特征评估CD8+T细胞功能。发现与对照相比，FADS敲低模型中几乎所有CD8+T细胞亚群都表现出改善的细胞毒性、减少的耗竭和增强的增殖（图3i）。差异基因富集分析显示，CD8+T细胞配体-受体信号传导、T细胞活化、趋化因子、细胞因子和细胞内信号转导上调（图3j）。

总之，FADS对TME内肿瘤细胞和CD8+T细胞都产生较大影响，而FADS的缺失重塑了免疫抑制性TME。

图3. 单细胞RNA测序分析揭示FADS对肿瘤微环境的影响

为研究肿瘤细胞FADS如何影响CD8+T细胞，研究人员将注意力集中到scRNA-seq分析挖掘到的趋化因子信号通路，其在肿瘤细胞和CD8+T细胞中都显著富集（图3e, j）。利用普通转录组测序分析，证实趋化因子受体结合趋化因子通路在FADS敲低细胞中显著上调，表明FADS可能通过趋化因子信号调节CD8+T细胞的募集。

接着研究团队又利用公共数据集，组织微阵列分析，流式细胞术等，证实FADS在HCC中抑制CD8+T细胞的募集，敲低FADS增加CD8+T细胞浸润。并依据转录组分析结果，推导调节机制：FADS可能通过抑制cGAS-STING通路的激活及下游趋化因子的表达，从而减轻活性氧（ROS）引发的DNA损伤，以阻碍CD8+T细胞募集。单细胞数据数据分析结果也支持这一推论，γH2AX染色评估DNA损伤实验、蛋白质印迹分析也分别验证了该调节机制。

FADS的缺失抑制了HCC细胞的生长，其潜在机制需要进一步研究。单细胞RNA测序分析表明，FADS基因敲低的肿瘤细胞中，与细胞死亡相关的代谢通路显著富集（图3e）。值得注意的是，在FADS敲低HCC细胞中观察到明显的细胞死亡，伴有细胞膜破裂（图5a）。为进一步解析代谢变化，研究团队对FADS敲低的Hep3B细胞进行非靶向代谢组学分析。结果显示，FADS敲低导致VB2水平增加，FAD水平降低，FMN水平无显著变化（图5b）。KEGG富集分析显示，谷胱甘肽代谢和多种脂质代谢途径，包括不饱和脂肪酸的生物合成和花生四烯酸代谢，发生显著改变（图5c）。具体来说，FADS敲低导致促铁死亡的多不饱和脂肪酸及其脂质过氧化产物12(S)-HETE的水平升高（图5d）。谷胱甘肽是主要的抗氧化剂，其水平在FADS敲低细胞中降低（图5e）。此外，在FADS敲低细胞中，脂质过氧化显著增加（图5f, g）。用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1处理挽救了FADS敲低引起的细胞死亡，而用铁死亡诱导剂Erastin处理则消除了FADS过表达提供的保护作用（图5g）。这些结果表明FADS促进了细胞对铁死亡的抵抗，其缺失会诱导铁死亡。

为确定这些发现是否是HCC中特异的，研究团队在乳腺癌细胞系MDA-MB-468和肺癌细胞系A549中也进行了相关实验，发现结果与在HCC细胞中一致，说明FADS在癌症研究中具有更广泛的意义。

图5. FADS生成FAD抑制铁死亡

随后，研究团队又通过大量分子实验，证实FADS赋予肿瘤细胞铁死亡抗性。具体机制包括：1）FADS通过其在FAD产生中的酶作用赋予HCC细胞铁死亡抗性；2）FADS通过与PCBP2相互作用抑制铁死亡；3）FADS招募USP10去泛素化并稳定PCBP2，从而维持细胞内二价铁离子稳态并阻止铁死亡。

目前，尚无可用的FADS抑制剂。为解决这一空白，研究团队进行了基于结构的高通量虚拟筛选，使用ChemDiv数据库（1,583,358种化合物）来搜索潜在的FADS抑制剂（图7a）。结合口袋设置在FADS C末端，包含酶催化中心。经过三轮筛选并应用对接得分大于10为阈值，将选择范围缩小到26个排名靠前的化合物。其中，五种商业可用且可大规模生产的化合物，被选作实验验证（图7b）。其中，橙皮苷在抑制细胞增殖方面表现出最有效的效果（图7c, d），临床上，橙皮苷也是已批准药物产品中的活性成分。

橙皮苷对HCC细胞增殖的抑制作用通过集落形成实验得到证实（图7e）。在皮下模型中，与对照组相比，橙皮苷治疗在Rag1-/-小鼠中显著抑制肿瘤生长，减少肿瘤重量（图7f），在C57BL/6小鼠中效果更强（图7g）。橙皮苷治疗还导致C57BL/6小鼠肿瘤内CD8+ T细胞浸润增加（图7l），并且通过组织病理学和血清生化分析表明未出现器官毒性迹象。

一系列实验证明橙皮苷诱导的铁死亡是通过抑制FADS介导的，显示出橙皮苷强大的抗肿瘤效果，突出了其作为HCC治疗候选物的潜力。

图7. 橙皮苷被鉴定为FADS抑制剂

之前几项流行病学研究探讨了VB2与癌症之间的关系，表明VB2代谢在不同癌症中具有复杂的、背景依赖性的作用，而本研究证明VB2代谢促进HCC进展。RFK和FADS是VB2代谢中的关键酶，在正常组织中RFK被认为是限速酶，然而，本研究数据显示，在HCC中广泛过表达的是FADS，而非RFK，这使FADS成为HCC中VB2代谢的主导者。为挖掘治疗潜力，本研究还筛选确定了橙皮苷作为一种潜在的FADS抑制剂，但目前尚缺乏其关于癌症患者治疗的临床数据，需要进一步研究。

总之，FADS通过两个主要机制促进HCC进展（图8）：(i) 促进肿瘤细胞中铁死亡抗性以支持肿瘤生长； (ii) 抑制CD8+T细胞的募集，从而抑制抗肿瘤免疫力。本研究证实FADS是HCC中一个有前景的治疗靶点。

图8. VB2代谢与FADS在HCC进展中的作用机制解析

获取原文：https://doi.org/10.1038/s41467-025-64572-y

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